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科研| 新鮮和儲存土壤樣品的直接細胞提取:對微生物組成的影響

編譯:微科盟如風 ,編輯:微科盟木木夕、江舜堯。

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導讀

從土壤樣品中直接提取活微生物對於許多與單細胞相關的技術的應用至關重要。但是,提取技術有許多方面會影響新鮮或儲存的土壤樣品中可提取細胞的活力和多樣性。在這項研究中,透過從四個具有不同理化特性的土壤樣品中連續兩次抽提細胞,優化了物理分散方法,化學分散方法和Nycodenz梯度培養基的濃度。細胞活力用熒光染色和流式細胞儀定量。在從死細胞中選擇性去除DNA後,評估土壤可提取細胞和土壤樣品中的微生物群落組成。在四種不同的提取和純化方法中,物理混合和80% Nycodenz離心的方案具有最高的細胞活力和產率。重複提取可提高產量,但會降低細胞活力。可提取細胞中微生物類群過高或不足可能影響提取微生物群落。使用最佳化的細胞提取程式,評估了土壤儲存條件(4℃,-80℃和風乾)對可提取細胞的產量,活力和群落組成的影響。在所有儲存的土壤樣品中,細胞活力均下降,但僅在風乾的土壤樣品中觀察到細胞產量的顯著下降。在所有儲存的土壤樣品中,微生物群落組成均發生了顯著變化,在4℃下儲存的土壤中觀察到的變化最小,這證實了4℃短期儲存適用於高效可行的細胞提取。綜上所述,所開發的方法為推進我們對土壤微生物生態學和單個微生物的作用的分析和理解提供了巨大的潛力。

論文ID

原名:Direct cell extraction from fresh and stored soilsamples: Impact on microbial viability and community compositions

譯名:新鮮和儲存土壤樣品的直接細胞提取:對微生物活力和群落組成的影響

期刊:Soil Biology and Biochemistry

IF:5。795

發表時間:2021。2

通訊作者:Aifen Zhou,Jizhong Zhou(周集中)

通訊作者單位:美國奧克拉荷馬大學;清華大學

試驗設計

從四川省的地點收集了四種表層土壤(深度為0-10釐米)。俄克拉荷馬州(表1)。土壤A是從2009年新建的變暖實驗區外部獲取的一塊壤土。土壤B是從1999年建立的實驗區外部獲取的黏土壤土。土壤C(砂壤土)和土壤D(壤土)。將每種土壤樣品均質化,並在提取細胞之前在4℃下儲存少於兩天。為了評估土壤貯藏條件對細胞活力和微生物群落組成的影響,將等分試樣(約200 g)的土壤樣品分別在4℃,-80℃或室溫下風乾。細胞提取前35天,要解凍-80℃時儲存的土壤樣品,將土壤樣品在20℃儲存1天,在4℃儲存1天。使用脫氧膽酸鈉(SD,水中0。1%)或Tween 20(T20,PBS緩衝液中0。5%)進行化學分散。測試了兩種Nycodenz濃度分別為80%和90%(在水中w/v)。收集原始土壤樣品和提取的細胞用於DNA提取,PCR和擴增子測序。總體實驗過程如圖1所示。

使用攪拌機將土壤進行物理分散。在Nycodenz純化之前,將土壤漿液保持在冰上。分散後,將土壤漿液離心。離心後,收集Nycodenz上方含有細胞的層,土壤提取的細胞透過離心沉澱。丟棄上清液,並將細胞沉澱重懸於5 ml PBS緩衝液中,並命名為“ 1st CELL”。將來自第一輪Nycodenz純化的土壤沉澱物重新懸浮在每個試管中的20 ml SD或T20中。第一次細胞提取後,將來自三個重複樣品的所得漿料合併在一起進行混合。再次分散土壤漿液以進行第二輪土壤細胞的提取和純化。在這一輪中收穫的細胞被稱為“2nd CELL”。為了透過渦旋進行物理分散,分別加入15 g的土壤和30 ml的SD 加入50毫升離心管中。然後將泥漿以最高速度渦旋振盪15分鐘。渦旋後,在無菌的Oak Ridge離心管中將20 ml土壤漿液緩慢新增到18 ml 80% Nycodenz的頂部,離心40 min,如上所述收集土壤細胞。如上所述進行了兩輪細胞提取。每個土壤樣品重複三次。SYBR Green I和碘化丙錠(PI)染色用於區分活的和死的土壤可提取細胞。單疊氮化丙錠(PMA)用於從沒有完整膜的細胞中去除DNA。最後進行土壤DNA提取及高通量擴增子測序

表1 試驗土壤理化性質。縮寫:SOC,土壤有機碳;TN,總氮。

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圖1土壤細胞提取過程的流程圖。A)分散。物理分散(渦旋和共混)和化學分散(脫氧膽酸鈉和Tween 20)。B)Nycodenz純化。將分散後的土壤漿液緩慢新增到80%或90%(w/v)Nycodenz。C)進行第二輪連續提取。D)使用PBS緩衝液洗滌提取的細胞,並用無菌過濾器(30μm孔徑)過濾。E)使用SYBR Green I和碘化丙錠對提取的細胞染色,然後使用流式細胞儀進行定量。F)單疊氮化丙錠(PMA)用於從死細胞中除去DNA。進行DNA提取和高通量測序。

結果

1 確定土壤中微生物細胞提取的最佳方案

我們使用以下方法評估了土壤可提取細胞的產量和生存力:物理分散度,化學分散度和Nycodenz濃度的四種萃取組合。所有提取均在不同型別的土壤(包括壤土,沙質壤土和黏土壤土)中進行兩次連續的提取(圖1)(表1)。經過兩輪提取和純化,土壤可提取細胞的總產量為4。5×106至2。6×107/g(圖2A)。總體而言,在四個測試土壤中,第一輪提取(佔總細胞的55-80%)比第二輪提取(佔總細胞的20-45%)回收的可提取細胞更多。將細胞存活率計算為活細胞數在細胞總數中的百分比。與2nd CELL相比,1st CELL獲得較高的細胞活力(圖2B)。在四種測試土壤中,1st CELL的細胞活力範圍為42%至75%,2nd CELL的細胞活力範圍為25%至61%(圖2B)。在物理分散方面,共混比渦旋迴收了更多的總細胞和可行的可提取細胞。與Tween 20(T20,0。5%的PBS緩衝液)進行化學分散相比,土壤可提取細胞的收率明顯高於脫氧膽酸鈉(SD,0。1%)。Nycodenz濃度從80%增加到90%對土壤可提取細胞的產量和活力影響不大(圖2)。VSN80的組合(渦流+ SD + 80%的Nycodenz)的活力最低,而BTN80的組合(摻混+ T20 + 80%的Nycodenz)的活力最高(圖2B)。考慮到細胞活力和產量,結果表明BTN80是土壤中提取細菌細胞的最佳組合。

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圖2 物理和化學分散以及Nycodenz濃度的不同組合下的土壤可提取細胞的產量(A)和生存力(B),以及細胞提取和純化的兩個連續輪次。用SYBR Green I和碘化丙錠透過活/死染色細胞的流式細胞術定量活力。使用方差分析測試了不同提取組合之間可提取細胞總產量差異的意義(p <0。05)。星號表示1st和2nd CELL之間的細胞活力有顯著差異(*p <0。05,**p <0。01,***p <0。001)。SD:脫氧膽酸鈉。

2 土壤提取細胞的微生物群落組成與原始土壤有顯著差異

使用16S rRNA擴增子序列分析原始土壤樣品和土壤提取細胞中的微生物群落組成,以評估土壤提取的細胞是否代表原始土壤微生物群落的多樣性。無論採用何種細胞提取程式,提取細胞(1st CELL和2nd CELL)中的微生物群落組成均與原始土壤樣品中的微生物群落組成顯著不同(圖3,p <0。001)。總體而言,在原始土壤樣品中,透過攪拌器和T20分散的細胞的微生物群落組成與群落更緊密地聚集在一起,尤其是在土壤C(砂壤土)的情況下。此外,1st CELL和2nd CELL具有不同的微生物群落組成(p <0。001)。總體而言,土壤樣品中的微生物富集度(觀察到的OTU)沒有差異,而與1st CELL或2nd CELL無關(圖S3)。在2nd CELL樣品中,VSN80方法的富集度最低。正如預期的那樣,PMA處理(從沒有完整膜的細胞中去除DNA)導致微生物群落與原始土壤樣品(p = 0。002)和提取的細胞(p <0。001)明顯不同,表明存在沒有完整膜的細胞在土壤和提取的細胞中(圖3和圖S4)。在原始土壤樣品中,PMA處理對豐富度(圖S3中的新鮮土壤,p = 0。83)和豐富的分類單元的相對丰度(> 1%)沒有顯著影響。相反,在提取的細胞中,PMA處理顯著降低了1st CELL和2nd CELL的富集度(圖S3,p <0。001),

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圖3不同提取方法對土壤或土壤可提取細胞中微生物群落UniFrac距離的非度量多維標度(NMDS)排序。左圖:未經單疊氮化丙錠(PMA)處理。右圖:經過PMA處理。PERMANOVA表示PMA,細胞組分和提取組合的顯著差異性(p <0。001)。

3 土壤可提取細胞中代表性微生物類群

在所有實驗條件下,在原始土壤樣品和可提取細胞中觀察到了(經PMA處理)和整個微生物群落組成之間的顯著差異(p = 0。002,PERMANOVA)(圖S4)。在門的水平上,無論如何採用PMA處理,土壤可提取細胞中關鍵細菌門的相對丰度與原始土壤樣品的相對丰度都存在顯著差異(圖S5)。同樣,在門的水平上,可行的群落通常顯示出Actinobacteria增加,但土壤可提取細胞中的Acidobacteria丰度降低(圖S5)。我們進一步分析了門和屬水平上的可行微生物群落,以揭示土壤中可提取細胞與總細胞之間差異的來源。比較土壤和透過BTN80方法最佳組合提取的細胞的微生物群落,在菌群水平上,從提取的細胞中回收了土壤中所有豐富的菌群(相對丰度> 1%,總共13個菌群)。僅在提取的細胞群中觀察到三個豐富的門,包括Chlamydiae(在所有四種土壤中),Armatimonadetes(在土壤D中)和Parcubacteria(在土壤C中),表明在可提取的細胞中某些門的可檢測性提高了。此外,在總細胞群和可提取細胞群中均發現了6個豐富的門,但其跳動現象卻大不相同(圖4和圖S5)。相對丰度在1st CELL中最高。與土壤相比,1st CELL中Actinobacteria和Verrucomicrobia的丰度通常較低,而2nd CELL中較高。在提取的細胞群體中,包括Acidobacteria, Bacteroidetes,和 Firmicutes的三種門均不足。在這裡,與所有三個門的總土壤種群相比,1st CELL和2nd CELL的相對丰度都較低。在屬水平上,提取的細胞群體中缺少許多屬。我們關注於在四個土壤中相對丰度> 0。1%的豐富屬。在豐富的屬中,有13個屬被認為是“難以提取”的類群,因為它們存在於土壤樣品中,但不存在於從至少三個土壤樣品中提取的細胞中。這些微生物大多數屬於Bacteroidetes, Firmicutes, 和 Proteobacteria(表2)。

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圖4 活的可提取細胞中幾種細菌門的相對丰度(> 1%)與原始土壤樣品相比有顯著差異(p <0。05,ANOVA)。使用PMA從死亡細胞中去除DNA。使用Blender + T20 + 80%Nycodenz的組合提取土壤細胞。小寫字母表示特定土壤樣品中土壤和細胞之間的顯著差異。

表2 土壤樣品中難以提取的屬的相對丰度(%)。

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難以提取的屬定義為存在於總土壤DNA提取物中的屬,但在至少三個土壤樣品中的相對丰度截止值為0。1%的提取細胞的DNA中不存在。ND表示特定土壤樣品中沒有該屬。*表示在提取的細胞中檢測到屬。SOM,土壤有機質。

4 土壤貯藏條件對土壤提取細胞產量和活力的影響

使用最佳化的細胞提取程式(BTN80),我們評估了土壤儲存條件(4℃,-80℃和風乾)對可提取土壤細胞的產量和生存能力的影響。與新鮮土壤相比,在4℃或-80℃下儲存對總提取細胞的產量沒有影響(圖5A),而在室溫下風乾則明顯降低了產量。在所有儲存條件下,1st CELL的活力均下降(圖5B),但在4℃儲存條件下,其活力下降最小(與新鮮土壤相比下降8。8-18%)。對於2nd CELL,新鮮土壤和4°C儲存的土壤之間沒有顯著差異。然而,在-80℃儲存或風乾的土壤樣品中觀察到細胞活力顯著降低。兩者合計,由於細胞死亡,土壤可提取細胞的活力對土壤儲存條件更為敏感。考慮到細胞產量和活力,確定4℃是儲存土壤樣品的最佳條件,-80℃是第二選擇,不建議風乾進行活細胞的提取和分離。

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圖5 儲存條件對從四種不同土壤樣品中提取的細胞的產量(A)和生存力(B)的影響。使用Blender + T20 + 80%Nycodenz的組合進行了兩輪連續的細胞提取。SYBR Green I和碘化丙錠染色用於區分活細胞和死細胞。差異的顯著性用ANOVA檢驗(p <0。05)。誤差棒代表標準偏差(n = 3)。小寫字母和大寫字母(B)分別表示1st CELL和2nd CELL的儲存條件之間的顯著差異。

5 貯藏條件改變了土壤和土壤提取細胞的微生物群落組成

土壤和土壤可提取細胞的活菌總數和總微生物群落組成都在三種儲存條件下發生了顯著變化(圖6和圖S6,p <0。001)。空氣乾燥比在4°C或-80°C下的儲存效果更強。總體而言,儲存在4℃的土壤樣品中的微生物群落組成更緊密地聚集在一起。此外,在三種儲存條件下,與新鮮土壤相比,土壤和提取細胞中總的微生物群落和存活的微生物群落的豐富度均下降(圖S7)。風乾樣品通常在土壤中的富集度最低,並且1st CELL含量最低。在三種儲存條件下第二細胞的豐富度沒有差異。與總微生物群落相比,存活的微生物群落對儲存條件更為敏感(圖6和S5)。與新鮮土壤相似,PMA處理在不同儲存條件下對總土壤種群(p <0。001)和提取的細胞種群(p <0。001)的微生物群落組成有顯著影響(圖6)。此外,用PMA處理的樣品在冷凍和風乾的樣品(圖S7)中顯示出顯著(p <0。001)較低的微生物富集度。然後分析了在門和OTU水平上的可行微生物群落組成,以發現源自土壤貯藏年齡條件的差異。就土壤樣品的微生物群落而言,豐富的門總體上未顯示新鮮土壤與4℃下儲存的土壤之間的差異。但是,在冷凍或風乾的土壤樣品中,幾種細菌門的相對丰度顯示出顯著變化(p <0。05)。例如,Proteobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes,和 Verrucomicrobia的相對丰度通常顯著較低,而Actinobacteria 和 Firmicutes的相對丰度通常較高。樣品在-80C或空氣乾燥的條件下比在新鮮土壤或4C的土壤中儲存的方法更勝一籌(圖7A)。同樣,在OTU水平上,與在-80℃或空氣乾燥條件下儲存的土壤相比,在4℃下儲存的土壤樣品中觀察到的響應性OTU較少(圖7B)。大多數響應式OTU,定義為相對OTU丰度的顯著變化,在-80°C的溫度下存放或風時, Proteobacteria, Acidobacteria,Actinobacteria, Bacteroidete, 和Verrucomicrobia。微生物群落組成發生了顯著變化。在1st CELL中,除了土壤C和D中Acidobacteria的相對丰度降低和Actinobacteria的相對丰度增加外,大多數豐富的門(> 1%)在新鮮土壤和4℃下儲存的土壤之間沒有差異。在4個土壤樣本中,在4℃下儲存的1st CELL中,在Proteobacteria中發現了700多個響應性OTU,儘管該門沒有顯示出差異(圖S8B)。與總的土壤微生物群落相似,Proteobacteria和Acidobacteria的相對丰度顯著下降,而從儲存-80℃或風乾的土壤樣品中提取的1st CELL中的放線菌增加了(圖S8A)。大多數響應式OTU都在這三種門都屬於80°C的儲藏或風乾(圖S8B)。儘管在門類水平上的差異有限,但是我們獲得的響應性OTU比原始土壤樣品的響應性更高,這表明這些提取的細胞對土壤儲存更敏感。在2nd CELL中,從風乾土壤樣品中提取的門的相對丰度存在較大差異。Proteobacteria和Verrucomicrobia丰度降低,而Actinobacteria和Firmicutes在從儲存於-80℃或風乾的土壤樣品中提取的2nd CELL中的丰度增加了(圖S9A)。同樣,在儲存條件下,大多數響應性OTU都位於這四個門中(圖S9B)。

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圖6 新鮮和儲存的土壤樣品中經過或未經過PMA處理的土壤細菌和土壤可提取細菌中微生物群落的非度量多維標度(NMDS)排序。

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圖7(A)新鮮和儲存的土壤樣品中幾種活菌門的相對丰度(> 1%)顯著不同。差異的顯著性用ANOVA檢驗(p <0。05)。(B)與相應的新鮮土壤樣品相比,儲存的土壤樣品中OTU的相對丰度變化(log2倍變化)。每個圓圈代表單個OTU,調整後的p值<0。1。

討論

從土壤中提取微生物細胞是應用於發現微生物活動的關鍵步驟。例如,已經廣泛挖掘了土壤中的微生物多樣性,以發現新型抗生素,抗癌化合物,酶和生物關於提取方法的先前工作通常集中於以細胞總數而不是活細胞總數評估的細胞回收效率的提高。在這項研究中,我們研究了提取程式和土壤儲存條件如何影響生存能力和微生物群落。使用不同土壤型別(壤土,沙質壤土和黏土壤土)的四種土壤樣品提取細胞的組成。在試驗條件下,土壤細胞提取方法的最佳組合,即使用攪拌器+ Tween 20 + 80% Nycodenz,具有最高的細胞活力和產量。重複的細胞提取可以提高總體細胞產量,但是在第二輪從土壤中提取細胞的過程中,其生存能力可能會受到損害。在-80℃的溫度下儲存土壤樣品或風乾會顯著降低細胞活力和/或產量。我們的結果表明,在本研究中測試的所有條件下,提取的總細胞與提取的總活細胞之間存在顯著差異,並且對於某些微生物學應用,著重於活細胞提取而不是總細胞是至關重要的。

我們對提取程式的測試證明了離子緩衝劑和非離子緩衝劑的組合以及重複提取的積極作用,但Nycodenz濃度的增加並未提高細胞產量。在物理分散方面,我們發現混合比渦旋具有更高的細胞產率和活力。儘管混合是一個苛刻的分散過程,但在間隔之間在冰上孵育三分鐘(短時間)和一分鐘,可能有助於維持細胞活力。相反,在室溫下連續15分鐘渦旋可能會破壞細胞完整性。化學分散是否能提高細胞產量仍存在爭議。與六種離子或非離子緩衝劑相比,它是適用於多種土壤質地的最佳緩衝劑。在我們的研究中,離子緩衝液和非離子緩衝液的組合(PBS緩衝液中的Tween 20)比SD產生的細胞產量和活力顯著更高,這表明緩衝液可能破壞不同形式的微生物附著在土壤顆粒上。重複提取對土壤中可提取細胞總數的貢獻很大(高出20%至40%)。這一發現與先前關於重複提取細胞的高回收率的研究一致。但是,應該注意的是,重複提取是費時的,而且更重要的是,它顯著降低了細胞的活力。細胞活力的降低可能歸因於重複的體力勞動所造成的損害分散,或在第二輪細胞提取中回收受損的膜完整性的細胞。我們的結果不支援Nycodenz濃度增加可以提高細胞產量的假設。植物密度細胞的濃度通常在1。11至1。20 g/ml之間。80%的Nycodenz具有約1。426 g/ml的密度,其密度足以回收大多數營養細胞。

對微生物群落組成的分析表明,經過兩輪混合和T20分散然後Nycodenz純化的土壤可提取細胞土壤微生物群落比其他測試組合更好。在每種細胞提取方法組合和每一輪提取中回收了不同的微生物群落,這表明每種物理和化學分散以及每一輪提取對某些微生物組都是有效的。為了回收更好地代表土壤樣品中原始微生物群落的微生物細胞,建議使用多種物理和化學分散組合。1st CELL和2nd CELL的組合可能更好地代表了原始的土壤微生物群落。與原始土壤相比,土壤提取細胞的微生物群落偏向的原因被認為通常由Proteobacteria, Acidobacteria,和 Verrucomicrobia。代表,而在細胞中Actinobacteria和Firmicutes代表不足。這些結果進一步強調了重複細胞提取在恢復與土壤微生物群落相似的土壤微生物群落中的重要性。

土壤原核生物包括幾類難於提取的微生物,包括能形成孢子,細胞呈絲狀,產生細胞外化合物和形成生物膜的微生物。例如,Virgisporangium,Sporosarcina和Tumebacillus(表1)是孢子形成體。由於這些孢子的密度可能高於Nycodenz,因此某些孢子可能無法透過Nycodenz密度離心法提取。這些大多數很難提取Bacteroidetes屬於Chitinophagaceae。這些微生物可以牢固地附著在幾丁質顆粒上,以降解幾丁質或其他土壤有機質。在這之中 Niastella和Solitalea組具有絲狀細胞形狀。它們與土壤有機物和顆粒的緊密結合可能使它們更難提取。雖然變形菌門的比例過高,但5個比較豐富的屬在提取的細胞中並沒有發現。這些屬中的大多數具有生物膜的生活方式並形成細胞聚集物。因此,使用密度比Nycodenz更高的密度梯度培養基可能有助於這些細胞的提取。為了恢復難以提取的屬,我們建議在第一輪細胞提取中使用最佳化的物理和化學分散體來回收最易提取的物質。然後,在第二次實驗中,可以使用更強的去汙劑和消化酶來分散緊密附著的細胞。在第三輪提取中,可使用溴化鈉(NaBr)密度梯度離心法提取孢子。立即從新鮮土壤中提取細胞是研究其微生物群落組成和功能的理想選擇。但是,由於許多原因,通常無法立即處理土壤,包括需要測試的大量土壤樣品,從現場到實驗室的運輸要求,以及從中提取細胞後難以保持細胞存活的原因。從新鮮和儲存的土壤樣品中分析可行的微生物群落提供了土壤貯藏條件對土壤可提取細胞活力的影響的證據。我們的分析表明,由於儲存條件的改變,土壤微生物的總數和存活率都發生了變化。根據我們的分析,建議在4℃下短期儲存,因為與新鮮土壤相比,僅觀察到微生物群落組成和可提取細胞產量的微小變化。相反,在-80℃或風乾後儲存會產生明顯的負面影響。對細胞活力和群落組成的影響。其他研究也表明,冷凍和風乾會顯著改變微生物的生物量和群落組成。

評論

本研究透過從四個具有不同理化特性的土壤樣品中連續兩次抽提細胞,優化了物理分散方法,化學分散方法和Nycodenz梯度培養基的濃度。評估土壤可提取細胞和土壤樣品中的微生物群落組成。在四種不同的提取和純化方法中,物理混合和80%Nycodenz離心的方案具有最高的細胞活力和產率。

本文章來源《微生態》公眾號

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