本期解讀

題目：

Human neural cell type-specific extracellular vesicle proteome defines disease-related molecules associated with activated astrocytes in Alzheimer’s disease brain

期刊：Journal of Extracellular Vesicles

影響因子：21。224

發表單位：美國波士頓大學醫學院

作者：Yang You et al。

發表時間：2022。1。13

研究手段：labelfree蛋白組學、TMT蛋白質組學

一、研究背景

阿爾茨海默病（AD）是一種普遍存在的神經退行性腦疾病，它影響著全球約4400萬人。雖然AD目前的特徵是大腦中存在澱粉樣蛋白-β（Aβ）斑塊和tau神經纖維纏結，但在疾病進展過程中，除Aβ和tau蛋白沉積之外的分子和細胞變化仍然難以捉摸。近年來，在細胞間發揮重要通訊作用的細胞外囊泡（EV）正成為疾病診斷、預後和治療的熱點。

二、研究結果

1.hiPSC衍生腦細胞的分化和表徵

作者首先用人類誘導多能幹細胞（hiPSC）分化成四種神經細胞型別：星形膠質細胞（iAstrocyte）、小膠質細胞（iMGL）、神經元（iNeuron）和少突膠質細胞（iOligo）（圖1a），並透過功能實驗和RT-PCR驗證分化的可靠性（圖1b-圖1f）。此外，利用非標定量質譜分析四種神經細胞的蛋白質組學，共鑑定了3206種蛋白質，其中，198種蛋白質是iNeuron獨有的，239種是iMGL獨有的，73種是iAstrocyte獨有的，47種是iOligo獨有的（圖1g）。此外，一些常見的細胞型別特異性蛋白標誌物分別在iNeuron（如MAPT）、iMGL（如AIF1、PU。1）、iAstrocyte（如AQP4）和iOligo（如OLIG2）中含量豐富（圖1h）。以上結果揭示了hiPSC有效分化為主要腦細胞型別。

圖1 腦細胞型別的分化和表徵。

2.從hiPSC衍生的腦細胞中分離和鑑定細胞外囊泡

作者利用分化的四種神經細胞來分離細胞外囊泡（EV）（圖2a），透過TEM和NTA分析所得到的EV。純化的EV在透射電子顯微鏡下顯示出帽形形態（圖2b），大多數人腦細胞衍生的EV的預期直徑範圍為50-150nm，除了iAstrocyte衍生的EV（圖2b），iAstrocyte-EV的平均直徑為222。0±2。6 nm，顯著高於其他神經細胞型別（圖2c）。進一步使用labelfree蛋白組學方法分析不同細胞型別的EV蛋白質組成，確定了iNeuron衍生EV （iNeuron-EV）特有的109種蛋白質、iMGL衍生EV（iMGL-EV）特有的197種蛋白質、iAstrocyte特有的378種蛋白質- EV和iOligo-EV獨有的117種蛋白質（圖2d），並且沒有發現非EV蛋白標誌物（圖2e），證明從hiPSC衍生的腦細胞中分離出的EV質量良好。同時，作者篩選了16個在所有細胞型別特異性EV中均有表達的蛋白（圖2f-圖2g），包括β-肌動蛋白（ACTB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、烯醇化酶1（ENO1）、熱休克蛋白（HSPA8）、Ras相關蛋白（RAB7A）、整合素 （ITGB1）、膜聯蛋白（ANXA1、2、5、6）、基礎免疫球蛋白（BSG）、一類過氧化物酶（PRDX1、2）、前列腺素F2受體負調節因子（PTGFRN）、皮離蛋白（DCD）、CD59。

圖2 從hiPSC衍生的腦細胞中分離和表徵細胞外囊泡。

3.神經細胞型別特異性EV蛋白質組的比較

基於無標記強度的絕對定量（iBAQ）方法比較了不同細胞型別的蛋白質丰度。主成分分析（PCA）對不同細胞型別特異性EV樣本具有較好的鑑別能力；EV蛋白質組的所有生物複製根據它們的表達譜形成獨立的簇，揭示了EV分離和非標定量蛋白質組學的高重現性（圖3a）。此外，Pearson相關係數在生物複製之間較高，而在不同細胞型別之間則低得多（圖3b）。以上結果證明了EV出色的生物重現性和潛在的細胞型別特異性蛋白質特徵。

在去除非EV汙染物後，對495種已鑑定不同細胞型別的EV蛋白進行聚類分析，並確定了細胞型別特異性EV蛋白特徵（圖3c），進一步進行基因富集分析，包括基因本體生物學過程（GO-BP）和KEGG（圖3d）。對於iNeuron-EV，富集的蛋白質主要與離子轉運、干擾素-γ介導的訊號傳導、MAPK級聯、神經元投射發育和胰島素分泌相關。對於iMGL-EV，生物學功能和通路主要與免疫過程有關，包括T細胞受體訊號傳導、核因子NF-κB介導的訊號傳導、抗原加工和呈遞、免疫反應或自身免疫性疾病。對於iAstrocyte-EVs，富集的蛋白質主要與細胞外基質相關，包括細胞粘附、細胞外基質（ECM）-受體相互作用和整合素介導的訊號傳導的生物學過程，以及糖酵解、丙酮酸代謝過程、膽固醇穩態、生物合成、氨基酸和碳代謝的代謝通路。最後，iOligo-EV中豐富的生物過程和通路涉及鐵離子穩態和溶酶體功能。總之，這些比較分析可能代表了EV中捕獲的每種細胞型別所特有的不同細胞功能。

圖3 hiPSC衍生的細胞型別特異性EV蛋白質組的比較分析。

4.hiPSC衍生的細胞型別特異性EV蛋白的鑑定

鑑於在不同的hiPSC衍生的神經細胞型別中觀察到明顯的EV蛋白特徵，研究透過篩選特定的特異性蛋白作為人腦EV的細胞型別特異性生物標記物。透過對EV蛋白質組的定量比較和倍數變化比較，初步篩選出合適的細胞型別特異性蛋白（圖4a-b），觀察到細胞骨架蛋白（MAP1LC3B2、TUBB2A）、突觸（VAMP2、STX1B）、能量過程（ATP1A3、ATP1B1）以及其他神經元特異性蛋白（RTN1、NCAM1）是iNeuron-EV特有的特徵蛋白。ITGB2、ITGAM/CD11b和LCP1，在iMGL-EV中高表達。對於iAstrocyte-EV，代謝轉運蛋白（SLC2A1、SLC1A5）、脂蛋白（APOE、LRP1）、星形膠質細胞特異性細胞表面抗原整合素（ITGA6/CD49f）以及波形蛋白高表達。最後在iOligo-EV中觀察到顯著富集的蛋白質包括溶酶體蛋白（LAMP2、ACP2）和鐵蛋白重鏈（FTH1）。然後透過蛋白質印跡方法進一步驗證特異性蛋白（圖4c-4d），最終確定將NCAM1、ATP1A3作為iNeuron-EV的標誌物，LCP1作為iMGL-EV的標誌物，LRP1、ITGA6、EAAT1作為iAstrocyte-EV的標誌物，LAMP2、FTH1和MOG作為iOligo-EV的標誌物。

圖4 細胞型別特異性EV蛋白的鑑定。

5. 人腦組織衍生EV的蛋白質組學分析

為了加強蛋白質組學發現並探索它們對臨床應用的潛在轉化，分析了來自30名人腦組織的EV，包括11名健康對照（HC）、8名輕度認知障礙患者（MCI）和11名AD患者（圖 5a）。使用TMT標記定量蛋白組學鑑定和量化EV蛋白，實驗共鑑定了4286種腦源性EV蛋白。根據蛋白質丰度，PCA顯示了三組之間的邊際分離（圖5b），然後透過單向方差分析和Tukey共鑑定到242個顯著改變的EV蛋白。透過對這些顯著差異表達蛋白（DEPs）的無監督分層聚類，可以觀察到與HC或MCI-EV相比，AD-EV中有130個上調DEPs，而112個DEPs的明顯下調（圖5c）。GO-BP富集分析表明，AD中上調的DEPs與細胞外基質、白細胞遷移、轉運和整合素介導的訊號通路有關，而下調的DEPs與DNA損傷識別、蛋白質摺疊和Cullin去內基化有關（圖5d）。另外，它們在細胞外外泌體的GO-MF分析中都高度表達，進一步證明了AD大腦中EV蛋白質組的顯著改變。

透過Tukey事後檢驗進一步縮小顯著性DEPs的範圍，共鑑定了42個DEPs，並從三組差異蛋白熱圖中確定了幾種疾病特異性DEPs（圖5e）。AD-EV特異性變化包括主要組織相容性II類細胞表面受體（HLA-DRA、HLA-DRB1、4、5）、S100鈣結合蛋白（S100A6和S100A10）、上皮膜蛋白3（EMP3）、細胞間粘附分子1（ICAM1）、整合素α5 （ITGA5）和澱粉樣前體蛋白（APP）。MCI-EV中參與氧化磷酸化（COX7C、COX7A2、NDUFA4）和 ATP酶 Na+/K+運輸家族成員（ATP1B4、ATP5MD、ATP5MG）的DEPs減少，而小型VCP/p97相互作用蛋白（SVIP）增加。此外，一些DEPs在HC、MCI和AD中呈漸進性增加，包括乳粘素（MFGE8）、CD163、S100A11、ANXA1、巨噬細胞甘露糖受體1（MRC1）和細胞色素P450蛋白（CYP4F11）。結果表明，這些疾病特異性的DEPs為區分從HC、MCI和AD大腦中分離出來的EV提供了可能。

圖5 從HC、MCI和AD的大腦中分離出的 EV 的蛋白質組學分析。

6. 細胞型別特異性AD-EV蛋白共表達網路的構建

為了對與疾病表型、特定細胞型別和生物途徑相關的蛋白質共表達模組進行分類，作者利用2645個共有蛋白構建了一個AD-EV蛋白質共表達網路，從共表達的蛋白質組中鑑定了11個模組，大小從720個蛋白質的最大模組M1到42個蛋白質的最小模組M11（圖6a）。為評估模組與AD病理學的重要性，將模組特徵蛋白與AD的神經病學特徵相關聯，包括Aβ斑塊負荷、神經原纖維纏結負荷和CDR評分（臨床痴呆評分），確定了與質膜的內在成分相關的M7模組與所有AD特徵具有最強的正相關性（圖6b）。

作者進一步對細胞型別特異性EV蛋白標誌物在每個共表達模組中的富集情況進行分析（圖6c），在M7模組中發現了iAstrocyte-EV標誌物的顯著富集，表明星形膠質細胞衍生的EV具有作為AD生物標誌物的潛力，並可能有助於病理發展。此外還透過疾病狀態測量了模組特徵蛋白值，以確定可能影響MCI到AD變化的EV蛋白網路（圖6d），與HC相比，M4、M6和M7模組在MCI中顯示出與AD中相同增加或減少趨勢，這意味著細胞粘附組裝、細胞對氮飢餓的反應和質膜的內在成分出現在AD的臨床早期，富含M4和M7的星形膠質細胞衍生的EV可能是AD進展的重要介質。M8、M9和M10模組在 MCI樣本中顯著變化，表明這些蛋白質網路在認知衰退中的短暫和特異性調節，以及它們在認知功能中的重要性。

圖6 腦源性EV蛋白質組的蛋白質共表達網路的構建與特定基因本體和腦細胞型別相關的模組。

7. M7/星形膠質細胞模組在啟用的星形細胞來源的EV標記物中富集，並與AD病理相關

作者進一步研究了M7/星形膠質細胞模組是否與啟用的星形膠質細胞衍生EV相關，發現M7和M6模組在活化的星形膠質細胞衍生的EV標記中顯示出顯著富集（圖7a），還觀察到 M7模組中啟用的星形膠質細胞衍生的EV標記物與前10箇中心蛋白密切相互作用，這些蛋白與AD特徵的顯著相關（圖7b）。獨創性路徑分析鑑定了與內吞作用、整合素訊號傳導和 NF-κB活化相關的多個重要的經典通路（圖7c）。

為了進一步驗證來自M7星形膠質細胞模組的EV蛋白是否與AD病理學相關，透過使用針對星形膠質細胞特異性EV標記LRP1和EAAT1的抗體進行免疫沉澱，從腦源性總EV中富集星形膠質細胞特異性 EV（圖7e）。免疫沉澱的EV樣品中存在新發現的星形膠質細胞標記ITGA6 37和常見的EV標記CD9、EAAT1和LRP1（圖7f）。值得注意的是，在免疫沉澱的 EV 樣品中檢測不到其他細胞型別特異性 EV 蛋白（ATP1A3、LCP1 和 FTH1），以上資料表明，使用針對EAAT1和LRP1的抗體成功地免疫沉澱了來自總腦源性EV的星形膠質細胞源性EV。在用EAAT1將強度標準化後，與對照組相比AD樣本中星形膠質細胞特異性 EV 中的 ITGB1 水平顯著增加，而ITGA6和CD9的水平沒有變化（圖7f）。值得注意的是，ITGB1水平也與AD致病標誌顯著相關（圖7g）。研究結果表明M7星形膠質細胞模組內EV蛋白共表達網路在AD發病機制中的起主要作用。此外，已鑑定的M7-EV蛋白（如ITGB1），特別是在星形膠質細胞特異性EV中，可用作潛在的AD生物標誌物。

圖7 M7模組富含活化的星形膠質細胞衍生的EV標誌物並參與炎症過程。

三、結論

文章對從hiPSC衍生的神經細胞和AD腦衍生的EV中分離的細胞型別特異性EV的組合蛋白質組學研究證明了EV分離的細胞型別特異性EV標記物的可用性和特異性，進一步的研究發現星形膠質細胞衍生EV中的ITGB1蛋白可作為潛在的AD生物標誌物。這些發現提高了我們對神經退行性疾病中EV生物學的理解，並有望開發出專門針對AD的新型診斷和治療靶點。

文章連結：

https：//doi。org/10。1002/jev2。12183

參考文獻：

You Y。 Satoshi M。 Mark P。 J。 et al。 Human neural cell type-specific extracellular vesicle proteome defines disease-related molecules associated with activated astrocytes in Alzheimer’s disease brain［J］。 Journal of Extracellular Vesicles， 2022， 11（1）： e12183。

編輯丨Aaliyah

稽核丨Tao Li