2．細胞融合的步驟

（1）製備飼養細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。

與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周齡

↓

拉頸 處死，浸泡在75%酒精內，3～5min

用無菌剪刀剪開面板，暴露腹膜

用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管）

反覆沖洗，吸出沖洗液

沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數至1×105/ml

加入96孔板，100μl/孔

放入37。c CO2孵箱培養

（2）製備免疫脾細胞

最後一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死

無菌取脾臟，培養液洗 一次

脾臟研碎，過不鏽鋼篩網

離心，細胞用培養液洗2次

計數

取108脾淋巴細胞懸液備用

（3）製備骨髓瘤細胞

取對數生長骨髓瘤細胞離心

用無血清培養液洗2次

計數，取得×107細胞備用

（4）融合

①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm，8min；棄上清，用吸管吸淨殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略鬆動。

②90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④離心，800rpm， 6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。

⑥將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

⑦將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。